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              美國Azaood公司Fast One Step Cloning Kit REF AZ00008產品介紹
              更新時間:2023-11-10   點擊次數:43次

              型號: AZ00008 

              儲運條件

              -20℃

              產品組成

              產品簡介

              基于重組原理的無縫克隆技術,作為新一代的克隆方法,不依賴繁瑣的酶切、連接步驟,也不需要末端補平等操作,依據DNA 片段與線性化載體末端的15~25 nt 同源序列的重組,可將插入片段克隆至任意線性載體的任意位點,載體自連背景低,是一種簡單、快速的DNA 定向克隆技術。

              Fast One Step Cloning Kit 無縫克隆試劑盒,一次反應可完成單至多個DNA 片段的重組,快僅需5 分鐘即可完成單片段重組,且陽性率高于95%。Kit 中添加的輔助因子,有效提高克隆陽性率;經優化的反應體系,能夠一定程度上耐受未純化PCR 產物中含有的雜質。升版的無縫克隆試劑盒具有更高的陽性率、更好的兼容性。

              實驗步驟

              1. 實驗流程概要

              2. 線性化克隆載體制備

              選擇合適的克隆位點,對載體進行線性化,載體的線性化可以通過酶切或反向PCR 擴增完成。

              ① 酶切制備

              一些限制性內切酶不能有效地消化超螺旋DNA,因此可能會留下不同數量的未切割載體DNA,降低陽性率。推薦使用LightNingTM 快速內切酶進行酶切(單酶切或者雙酶切),使載體線性化wanquan,以降低轉化背景(未切割的載體轉化獲得的假陽性克?。?。

              注1:經酶切進行線性化的載體無需去磷酸化,推薦使用雙酶切。

              注2:酶切完成后,建議將內切酶失活或對目的產物純化后用于重組反應。

              ② 反向PCR 擴增制備

              為減少擴增突變的引入,推薦使用高保真PCR Mix 進行擴增。推薦使用預線性化質粒作為模板,以減少環狀質粒模板殘留對克隆陽性率的影響。

              注1:PCR 產物無非特異性條帶時, 推薦使用Template Eliminator( 貨號:EG21203)消化質粒模板即可用于重組反應;反之建議將PCR 產物純化后使用。

              注2:多片段克隆時,建議將PCR 產物純化后使用。

              3. 插入片段PCR 引物設計

              PCR 引物的5' 端必須包含與其相鄰片段(插入片段或載體)末端同源的15~25 nt(推薦18 nt)序列。假如載體為粘性末端,且3' 端突出,則引物設計必須包含突出部分;若5' 端突出,則引物設計可以包含突出部分,也可以不包含。

              插入片段正向擴增引物:

              5'—上游載體末端同源序列+ 酶切位點(可選)+ 基因特異性正向擴增序列— 3'

              插入片段反向擴增引物:

              3'—基因特異性反向擴增序列+ 酶切位點(可選)+ 下游載體末端同源序列—5'

              注1:盡量選擇無重復序列且 GC 含量均勻的區域進行克隆,當載體克隆位點上下游25 nt 區域內 GC 含量為40%~60% 時,重組效率高;

              注2:本試劑盒所提供的pUC 19 載體(Ampr)連接端序列如下:

              4. 插入片段的PCR 擴增

              推薦使用高保真PCR Mix 進行擴增,以減少擴增突變的引入。建議使用純化后的PCR 產物進行無縫克隆反應,若PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定為特異性擴增產物,可直接使用,但加樣體積不應超過總反應體積的20%。

              5. 重組反應

              ① 于冰水浴中配置以下反應體系:

              a. 適載體用量(ng) = 0.02 × 載體堿基對數,即0.03 pmol。

              b. 插入單片段,適片段用量(ng)= 0.04 × 片段堿基對數;插入多片段,每片段適用量(ng)= 0.02 × 片段堿基對數。

              注1:若插入單片段的長度大于載體,則應互換載體與插入片段用量;

              注2:若插入片段的長度小于200 bp,則插入片段應使用5 倍載體用量;

              注3:若按上述公式計算得到的用量超過低/ 高值,則建議直接按低/ 高用量使用;

              注4:載體片段過長、插入片段過長或片段數過多,克隆陽性率均會降低。

              重組反應體系配制完成后,用移液槍輕輕吸打混勻各組分,避免產生氣泡,切勿渦旋。

              ② 將反應體系置于50℃,反應5~60 min。

              注1:推薦使用 PCR 儀等溫控比較jingzhun的儀器進行反應,反應時間不足或太長克隆效率均會降低;

              注2:插入1~2 個片段時,推薦反應時間為5~15 min;插入3~5 個片段時,推薦反應時間為15~30 min;

              注3:當載體骨架在10 kb 以上或插入片段在4 kb 以上時,建議延長反應時間到30~60 min;

              注4:50℃反應完成后,建議進行瞬時離心,將反應液收集至管底。

              ③ 將反應液離心管置于冰上冷卻,之后進行轉化或者儲存于 -20℃。

              注 1: -20℃儲存的重組產物,建議在 1 周內使用。

              6. 重組產物轉化

              取5~10 μl 反應液,加入到100 μl 感受態細胞中,緩慢吸打混勻,冰上放置30 min。42℃ 熱激45~60 sec,冰浴5 min。加500 μl SOC或 LB 培養基,37℃ 振蕩培養40~60 min(200 rpm)。將菌液均勻涂布在含有對應抗生素的平板上,倒置于37℃ 過夜培養。

              注1:不同感受態細胞后的克隆陽性率會有所差別,推薦使用轉化效率 > 108 CFU/μg的感受態細胞;

              注2:菌落數取決于PCR 產物與線性化載體的數量和純度;

              注3:陽性對照平板通常生長大量白色單菌落,陰性對照平板只生長很少的菌落。

              7. 陽性克隆檢測

              挑取單菌落至10 μl ddH2O 中混勻,95℃裂解10 min 后,取1 μl裂解液作為模板,進行菌落PCR 鑒定,或將單菌落接種至抗性培養基中培養過夜后,提取質粒進行酶切鑒定。

              陽性對照的陽性克隆檢測,菌落PCR 引物使用通用引物M13F 與M13R,酶切鑒定用HindIII 與EcoRI。

              注1:菌落PCR 時建議至少使用一條通用引物,避免假陽性結果;

              注2:必要時可進一步對陽性結果進行測序鑒定。

              注3:M13F:TGTAAAACGACGGCCAGT

              M13R:CAGGAAACAGCTATGAC


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